科技文献中有很多抗体标记方法指南，我们往往难以选择最佳方法。本指南可以帮助您更好的理解标准化学标记方法及它们的优缺点，同时还介绍了 Lightning-Link一步法抗体标记技术。...
科技文献中有很多抗体标记方法指南，我们往往难以选择最佳方法。本指南可以帮助您更好的理解标准化学标记方法及它们的优缺点，同时还介绍了 Lightning-Link一步法抗体标记技术。该技术极大简化了抗体标记步骤，利用该技术标记抗体不需要您具备太多化学方面的知识，并且手头操作时间仅需短短的30秒！
抗体与标记物
在多种免疫实验（流式细胞术, ELISA, western blotting, 免疫组化等）中，抗体被广泛应用于检测和定量抗原。直接识别抗原的抗体被称为一抗（primary antibody），赋予检测的特异性。大多数免疫检测中还需加入标记物，赋予实验可检测性。标记物包括有机染料、荧光蛋白、有色微粒和酶。
直接检测法 Vs.间接检测法
包含标记物的免疫检测一般有直接法和间接法两种形式。直接检测法中，标记物通过共价键直接连接到一抗上。而对于间接检测法，标记物则是共价连接到与一抗特异性结合的二抗上。间接法检测包括两步：第一步，用未标记的一抗进行孵育，抗体与抗原结合（若存在抗原），洗去未结合的抗体（一般3~5次），第二步则是加入标记二抗孵育（通常1小时），洗涤去掉未结合的二抗，然后量化结合在一抗上的标记物。
在直接法中，标记物直接与一抗共价结合，因此仅需与含有抗原的样本孵育这一步骤，而且只需一次洗涤，而间接法则需要两轮孵育与洗涤步骤。直接法简化了试验的流程，降低了试验的变异性，增加了数据的可靠性。然而一抗的共价修饰可以导致抗体亲和力的改变，这种情况的出现与标记二抗带来的非特异性结合的问题相比而言，显得无关紧要。下表列举出了直接法与间接法的主要优缺点比较。
表.直接法与间接法的比较
既然直接标记法具有很多优点，但为何众多的免疫分析仍采用间接法呢?原因是市场上带有标记的一抗较少，而且直接标记一抗较困难，这在过去也许是您的困扰，但是当您读到本篇指南的最后时就会对抗体标记充满信心。
抗体标记方法
您仅需理解基本的化学原理，哪些基团发生反应，根据化学结合物的种类去选择合适的试剂，而不需要纠结化学结构和完整的化学名称。抗体和所有蛋白一样，是由氨基酸残基组成的。蛋白的氨基基团（N-末端及赖氨酸残基的侧链）通常被用于共价链接标记物。尽管在文献中报道了多种多样的标记方法和成百上千的化学修饰试剂，然而实际上只有少数重要的方法和试剂。无论何种方法，几乎毫无例外的都是将标记物共价连接到抗体分子的赖氨酸残基上。
以下是几种主要的抗体标记方法：
1.琥珀酰酯 (NHS)法
当使用荧光染料标记时，通常可购买内配有NHS琥珀酰酯（也称为琥珀酰亚胺酯）的活化标记物。在适当条件下，活化的染料可与抗体分子反应（抗体分子通常含有多了赖氨酸基团）而形成结合物。根据标记抗体和游离染料的大小不同，过量的活性染料可通过层析法去掉，纯化的步骤会导致一部分标记抗体的损失，但是为了避免实验的高背景，这些纯化步骤是必要的。
2.碳二亚胺（Carbodiimides）法
这类试剂（常见的如EDC）在氨基和含羧基的分子间形成共价连接。碳二亚胺活化羧基，活化的中间体随后被氨基（抗体分子的赖氨酸残基）吸附。碳二亚胺通常用于连接抗体和羧化的颗粒（如乳胶颗粒、磁珠），以及其他羧化的表面如微孔板。碳二亚胺很少用于将蛋白标记物偶联到抗体上，因为这两种分子都含有氨基（赖氨酸）和羧基。大多数碳二亚胺试剂都不溶于水，因此它们主要用于有机合成化学，比如生产NHS活性染料。真正用于蛋白/抗体标记的碳二亚胺试剂为EDC（也称为EDAC），常以盐酸盐的形式出售。
3.过碘酸钠（Sodium periodate）法
过碘酸钠是一种用于活化辣根过氧化物酶的强氧化剂。这种过碘酸盐与糖链反应产生能与抗体的赖氨酸残基反应的醛基。由于HRP分子本身含有很少的赖氨酸，因而相对容易获得抗体-HRP结合物，且无明显的HRP多聚化发生。该方法的缺点是赖氨酸和醛基结合物的形成是可逆的，只有在硼氢化钠还原剂的作用下才能稳定，然而硼氢化钠有一定的危险性。
4. 异硫氰酸盐（Isothiocyanate）法
该方法值得特别一提是因为FITC（异硫氰酸荧光素）的重要意义。FITC作为抗体和蛋白的标记物已使用了很多年。异硫氰酸盐较NHS琥珀酰亚胺酯稳定，因此在保存中不易分解，但是与抗体的反应性较差。FITC不溶于水，须溶于有机溶剂。该方法的局限性在于反应需在PH9.5或更高的条件下进行，否则标记反应会非常缓慢，然而一些单克隆抗体在高PH条件下可能会被破环。
5.异（基）双功能试剂 (Heterobifunctional reagents)
当标记物为蛋白分子（如碱性磷酸酶AP、藻红蛋白PE）时，由于抗体和标记分子都含有大量赖氨酸残基，因此标记流程略为复杂，可能发生预期外的其他反应。在这种情况下，通常需要对其中一个分子（如抗体）的一些赖氨酸进行修饰，以此创造一个新的反应基团（X），而标记物上的赖氨酸作为另一个反应基团（Y）。当抗体与标记物混合时，利用双功能试剂引入Y基团，随之与X基团发生反应，从而形成异二聚体结合物（即标记抗体）。该方法的主要缺点是标记前需要一些分离步骤将X标签结合到抗体上，这些分离步骤对标记反应是不利的。
缓冲液及添加物--抗体标记的关键因素
抗体溶液中除抗体蛋白分子外，可能还含有少量其他物质如缓冲液、盐、或其他蛋白及添加物。添加物对不同标记方法的影响程度不同，但绝大多数的标记抗法都是利用抗体分子上的赖氨酸残基，因此在标记反应中应避免加入含有伯胺的缓冲液或添加物。有时，标记反应前需要重新纯化抗体，尤其当抗体中含有稳定蛋白（BSA）或低分子量物质（叠氮化钠、Tris、甘氨酸）时。甘氨酸和Tris缓冲液常用来纯化和中和抗体，最后加入叠氮化物来防止微生物的滋生。纯化实验中常用低PH值的柠檬酸洗脱抗原亲和柱上的抗体，然而柠檬酸会对碳化二亚胺参与的反应产生严重的干扰。因此，纯化过的抗体在标记前需要进行透析。需要特别注意的是，透析时如能更换2-3次缓冲液，那么去除小分子杂质的效率更高。这并不意味着您需要准备3倍或更大量的缓冲液一次性来透析，恰恰相反，多次透析延长了透析的时间，从而达到更好的杂质去除效果。如用1L的缓冲液透析3次的效果远比用5L的缓冲液透析一次的效果好。如果透析后需要加入叠氮化合物，尽可能使用最低的浓度（如0.02%）或者将抗体以浓缩形式保存。例如，在5mg/ml 抗体中加入0.02%叠氮化物，若后续标记实验使用1mg/ml 抗体时，叠氮化物的浓度则降低为0.004%；然而如果将0.1% 叠氮化物加入0.5 mg/ml抗体溶液中，毫无疑问会对标记反应产生严重的干扰。
抗体浓度及纯度
大多数标记反应对抗体都有一个纯度要求（如>90%，最好>95%）和浓度要求（至少0.5mg/ml）。市售的许多商业化抗体一般都是适用于标记的纯化形式，但并非所有情况都如此，有些抗体常以杂交瘤组织培养上清（TCS）、腹水或血清等形式出售。TCS通常含有多种其他蛋白和培养基营养物质（如氨基酸），这对于标记是个非常大的问题。如果您使用的是TCS，那么纯化（如过蛋白A柱）步骤则是必需的。腹水和血清原液中的抗体浓度较TCS中的抗体浓度高，但它们同样也是不纯的，含有高浓度的干扰物质，进一步的纯化往往也是必要的。
上述介绍了最常用的传统标记方法以及每种方法的优势和劣势。下面要介绍一种新式的标记方法（Lightning-Link®），该方法相比传统方法有很多优势。
抗体与标记物
在多种免疫实验（流式细胞术, ELISA, western blotting, 免疫组化等）中，抗体被广泛应用于检测和定量抗原。直接识别抗原的抗体被称为一抗（primary antibody），赋予检测的特异性。大多数免疫检测中还需加入标记物，赋予实验可检测性。标记物包括有机染料、荧光蛋白、有色微粒和酶。
直接检测法 Vs.间接检测法
包含标记物的免疫检测一般有直接法和间接法两种形式。直接检测法中，标记物通过共价键直接连接到一抗上。而对于间接检测法，标记物则是共价连接到与一抗特异性结合的二抗上。间接法检测包括两步：第一步，用未标记的一抗进行孵育，抗体与抗原结合（若存在抗原），洗去未结合的抗体（一般3~5次），第二步则是加入标记二抗孵育（通常1小时），洗涤去掉未结合的二抗，然后量化结合在一抗上的标记物。
在直接法中，标记物直接与一抗共价结合，因此仅需与含有抗原的样本孵育这一步骤，而且只需一次洗涤，而间接法则需要两轮孵育与洗涤步骤。直接法简化了试验的流程，降低了试验的变异性，增加了数据的可靠性。然而一抗的共价修饰可以导致抗体亲和力的改变，这种情况的出现与标记二抗带来的非特异性结合的问题相比而言，显得无关紧要。下表列举出了直接法与间接法的主要优缺点比较。
表.直接法与间接法的比较
| 方法 | 优点 | 缺点 |
| 直接法 |
操作简单，结果可靠； 仅需使用一抗，检测快速； 无二抗的非特异性结合。 |
由于标记可能导致一抗的免疫反应性降低； 信号放大作用较弱。 |
| 间接法 | 一抗含有多个标记二抗可结合的表位，因而灵敏度升高，信号放大作用较强。 |
二抗可能发生非特异性结合； 孵育及洗涤步骤增多。 |
既然直接标记法具有很多优点，但为何众多的免疫分析仍采用间接法呢?原因是市场上带有标记的一抗较少，而且直接标记一抗较困难，这在过去也许是您的困扰，但是当您读到本篇指南的最后时就会对抗体标记充满信心。
抗体标记方法
您仅需理解基本的化学原理，哪些基团发生反应，根据化学结合物的种类去选择合适的试剂，而不需要纠结化学结构和完整的化学名称。抗体和所有蛋白一样，是由氨基酸残基组成的。蛋白的氨基基团（N-末端及赖氨酸残基的侧链）通常被用于共价链接标记物。尽管在文献中报道了多种多样的标记方法和成百上千的化学修饰试剂，然而实际上只有少数重要的方法和试剂。无论何种方法，几乎毫无例外的都是将标记物共价连接到抗体分子的赖氨酸残基上。
以下是几种主要的抗体标记方法：
1.琥珀酰酯 (NHS)法
当使用荧光染料标记时，通常可购买内配有NHS琥珀酰酯（也称为琥珀酰亚胺酯）的活化标记物。在适当条件下，活化的染料可与抗体分子反应（抗体分子通常含有多了赖氨酸基团）而形成结合物。根据标记抗体和游离染料的大小不同，过量的活性染料可通过层析法去掉，纯化的步骤会导致一部分标记抗体的损失，但是为了避免实验的高背景，这些纯化步骤是必要的。
2.碳二亚胺（Carbodiimides）法
这类试剂（常见的如EDC）在氨基和含羧基的分子间形成共价连接。碳二亚胺活化羧基，活化的中间体随后被氨基（抗体分子的赖氨酸残基）吸附。碳二亚胺通常用于连接抗体和羧化的颗粒（如乳胶颗粒、磁珠），以及其他羧化的表面如微孔板。碳二亚胺很少用于将蛋白标记物偶联到抗体上，因为这两种分子都含有氨基（赖氨酸）和羧基。大多数碳二亚胺试剂都不溶于水，因此它们主要用于有机合成化学，比如生产NHS活性染料。真正用于蛋白/抗体标记的碳二亚胺试剂为EDC（也称为EDAC），常以盐酸盐的形式出售。
3.过碘酸钠（Sodium periodate）法
过碘酸钠是一种用于活化辣根过氧化物酶的强氧化剂。这种过碘酸盐与糖链反应产生能与抗体的赖氨酸残基反应的醛基。由于HRP分子本身含有很少的赖氨酸，因而相对容易获得抗体-HRP结合物，且无明显的HRP多聚化发生。该方法的缺点是赖氨酸和醛基结合物的形成是可逆的，只有在硼氢化钠还原剂的作用下才能稳定，然而硼氢化钠有一定的危险性。
4. 异硫氰酸盐（Isothiocyanate）法
该方法值得特别一提是因为FITC（异硫氰酸荧光素）的重要意义。FITC作为抗体和蛋白的标记物已使用了很多年。异硫氰酸盐较NHS琥珀酰亚胺酯稳定，因此在保存中不易分解，但是与抗体的反应性较差。FITC不溶于水，须溶于有机溶剂。该方法的局限性在于反应需在PH9.5或更高的条件下进行，否则标记反应会非常缓慢，然而一些单克隆抗体在高PH条件下可能会被破环。
5.异（基）双功能试剂 (Heterobifunctional reagents)
当标记物为蛋白分子（如碱性磷酸酶AP、藻红蛋白PE）时，由于抗体和标记分子都含有大量赖氨酸残基，因此标记流程略为复杂，可能发生预期外的其他反应。在这种情况下，通常需要对其中一个分子（如抗体）的一些赖氨酸进行修饰，以此创造一个新的反应基团（X），而标记物上的赖氨酸作为另一个反应基团（Y）。当抗体与标记物混合时，利用双功能试剂引入Y基团，随之与X基团发生反应，从而形成异二聚体结合物（即标记抗体）。该方法的主要缺点是标记前需要一些分离步骤将X标签结合到抗体上，这些分离步骤对标记反应是不利的。
缓冲液及添加物--抗体标记的关键因素
抗体溶液中除抗体蛋白分子外，可能还含有少量其他物质如缓冲液、盐、或其他蛋白及添加物。添加物对不同标记方法的影响程度不同，但绝大多数的标记抗法都是利用抗体分子上的赖氨酸残基，因此在标记反应中应避免加入含有伯胺的缓冲液或添加物。有时，标记反应前需要重新纯化抗体，尤其当抗体中含有稳定蛋白（BSA）或低分子量物质（叠氮化钠、Tris、甘氨酸）时。甘氨酸和Tris缓冲液常用来纯化和中和抗体，最后加入叠氮化物来防止微生物的滋生。纯化实验中常用低PH值的柠檬酸洗脱抗原亲和柱上的抗体，然而柠檬酸会对碳化二亚胺参与的反应产生严重的干扰。因此，纯化过的抗体在标记前需要进行透析。需要特别注意的是，透析时如能更换2-3次缓冲液，那么去除小分子杂质的效率更高。这并不意味着您需要准备3倍或更大量的缓冲液一次性来透析，恰恰相反，多次透析延长了透析的时间，从而达到更好的杂质去除效果。如用1L的缓冲液透析3次的效果远比用5L的缓冲液透析一次的效果好。如果透析后需要加入叠氮化合物，尽可能使用最低的浓度（如0.02%）或者将抗体以浓缩形式保存。例如，在5mg/ml 抗体中加入0.02%叠氮化物，若后续标记实验使用1mg/ml 抗体时，叠氮化物的浓度则降低为0.004%；然而如果将0.1% 叠氮化物加入0.5 mg/ml抗体溶液中，毫无疑问会对标记反应产生严重的干扰。
抗体浓度及纯度
大多数标记反应对抗体都有一个纯度要求（如>90%，最好>95%）和浓度要求（至少0.5mg/ml）。市售的许多商业化抗体一般都是适用于标记的纯化形式，但并非所有情况都如此，有些抗体常以杂交瘤组织培养上清（TCS）、腹水或血清等形式出售。TCS通常含有多种其他蛋白和培养基营养物质（如氨基酸），这对于标记是个非常大的问题。如果您使用的是TCS，那么纯化（如过蛋白A柱）步骤则是必需的。腹水和血清原液中的抗体浓度较TCS中的抗体浓度高，但它们同样也是不纯的，含有高浓度的干扰物质，进一步的纯化往往也是必要的。
上述介绍了最常用的传统标记方法以及每种方法的优势和劣势。下面要介绍一种新式的标记方法（Lightning-Link®），该方法相比传统方法有很多优势。
